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一、實驗目的
通過檢測細胞活力來驗證目的基因?qū)毎鲋车挠绊懀蝌炞C某種藥物對細胞的毒性。

二、實驗原理
Cell Counting Kit-8(簡稱 CCK8) 試劑中含有 WST-8。活細胞特別是增殖期細胞的線粒體中的琥珀脫氫酶能夠使 WST-8 還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比，用酶標儀在 450nm 波長處測定其吸收值，即可間接反映細胞增殖情況。

三、實驗步驟
1. 將細胞以 104-105 個細胞/孔的密度接種在  96 孔板中，加入 100μL 培養(yǎng)基，含或不含待測化合物。在 CO2 培養(yǎng)箱中在 37℃ 下培養(yǎng)細胞 24 小時。
2. 向板中加入 10μL 不同濃度的待測物質(zhì)。
3. 在培養(yǎng)箱中將培養(yǎng)板培養(yǎng)適當時間（如 6、12、24 或 48 小時）。
4. 向板的每個孔中加入 10μL CCK-8 溶液。小心不要將氣泡引入孔中。
5. 將平板在培養(yǎng)箱中孵育 1-4 小時。
6. 在讀板之前，在定軌振蕩器上輕輕混勻。
7. 使用酶標儀測量 450nm 處的吸光度。

四、常見問題及解答
Q1：做細胞活性檢測時，每孔應該接種多少個細胞？
A：當使用標準 96 孔板時，貼壁細胞一般最小接種量為 1,000 個/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于 2,500 個/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)，當然，也有部分極其靈敏的試劑盒或可檢測更少量的細胞。

Q2：若是使用 6 孔或者 24 孔板進行試驗，CCK 試劑使用量怎么樣呢？
A：如果要使用 6 孔板或 24 孔板實驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的 10% 加入 CCK8 溶液。

Q3：培養(yǎng)基的本底顏色如酚紅會不會影響細胞活性的檢測呢？
A：不會的，培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光值而消去，因此不會對檢測造成影響。

Q4：只可以在 450nm 波長處測 OD 值嗎？
A：可以在 450nm 波長處測 OD 值，但是若無此波長的濾光片，可選擇吸光度在 430-490 nm 之間的濾光片，但是 450 nm 濾光片的檢測靈敏度最高。

Q5：若是暫不檢測 OD 值，該如何處理？
A：若暫時不測定 OD 值，可以向每孔中加入 10 μL 0.1 M 的 HCL 溶液或者 1% w/v SDS 溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24 小時內(nèi)測定，吸光度不會發(fā)生變化。

Q6：在實驗中 OD 值太高，怎么解決？
A：CCK-8 試劑后的培養(yǎng)時間由 2 小時縮短為 1 小時。此外，可適當減少細胞的數(shù)量。

Q7：應該每次做標準曲線嗎？
A：建議每次做。雖然細胞是一樣的，但是細胞的狀態(tài)不一定一樣。對于狀態(tài)不一樣的細胞，建議每次做標準曲線。